恩博报道
单细胞测序技术自问世以来，热度一直居高不下，目前已经在肿瘤、神经、发育、生殖等众多领域被广泛应用，近几年高分文章层出不穷。
近年来，随着科研水平的快速发展，许多专家和学者逐步将目光聚焦于其他热点技术与单细胞测序的联合使用上，而作为液体活检领域的明星分子-外泌体，在临床诊断，治疗以及预后等方面都具有重要的研究价值，但是目前鲜有关于两者关联分析的报道。
作为“最火”的单细胞测序以及“最热”的外泌体，究竟能够产生怎么神奇的化学反应呢？
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下面让我们通过年发表在Neuro-Oncology（IF=10.）的一篇关于髓母细胞瘤的文章Anextracellularvesicle-relationgeneexpressionsignatureidentifieshigh-riskpatientsinmedulloblastoma，一起进行“外泌体+单细胞”的探秘吧！
研究背景
髓母细胞瘤Medulloblastoma(MB)是一种常见的儿童颅内恶性肿瘤，根据分子分型包括wingless(WNT)，sonichedgehog(SHH)，Group3以及Group4等四种亚型，其中不同亚型之间高风险患者的鉴别一直是治疗过程的难点。
研究思路
研究结果
一、小鼠SHH型MB肿瘤组织单细胞图谱分析
作者利用Atoh1-cre:SmoM2突变体构建小鼠SHH-MB模型，对4例荷瘤小鼠的肿瘤组织进行scRNA-seq测序，共检测到个细胞，并聚类成了8个不同的细胞亚群。其中，亚群1-6是肿瘤细胞，亚群7是胶质细胞，亚群8是免疫相关细胞(图1A)。亚群1-6中Cd24a（SHH-MB中的特异marker基因）呈现过表达的特点，但是亚群7，亚群8或者正常的小脑细胞CB则不表达（图1B）。同时，在不同类型的小脑细胞中，肿瘤细胞与颗粒神经元前体细胞GNPs的相关性最高（图1C，1D）。紧接着，作者进行了拟时分析。结果显示，正常组织中GNPs会分化成2类成熟的颗粒细胞类群，但是肿瘤细胞在分化过程中发生阻断，无法达到最终的分化状态（图1E）。同时通过轨迹推断对肿瘤细胞的异质性也进行了分析，发现其可以分为2个主要的亚群——ABCD以及EFG(图1F，1G)。前者主要表达颗粒细胞有丝分裂后期的相关基因，后者包括神经胶质，氧化磷酸化以及核糖体相关的若干基因（图1H，1I）。这种分类结果和临床上的治疗结果是具有相关性的，比如高表达的VIS_down基因标签（包括56个差异表达的基因）的肿瘤细胞亚群，表现出对smo抑制剂vismodegib治疗敏感的特点（图1I）。图1小鼠单细胞转录组图谱构建
然后，作者又对于细胞亚群7和8分别进行了GO功能分析，结果显示它们分别富集在胶质细胞以及免疫细胞的相关功能上（图2A）。其中，巨噬细胞是亚群8中的主要细胞类型，与SHH-MB中巨噬细胞参与的免疫调节有关（图2B，2C）。亚群7包括了星形胶质细胞AS以及少突胶质细胞OL(图2D，2E)。并且，在OL细胞分化过程中，少突胶质前体细胞OPCs在亚群7中占比最多（图2F）。图2细胞亚群特征分析
二、SHH-MB肿瘤细胞的转录组重编程
作者进行了SHH-MB肿瘤细胞以及非转化的小脑CB细胞的转录组分析，一共筛选到个差异表达的基因，其中75%的为上调基因（图3A）。对这些基因进行功能分类，结果显示，其主要集中在RNA/蛋白质合成，蛋白质转运，细胞骨架合成以及G蛋白信号通路等（图3B）。同时，肿瘤细胞内参与脂肪酸合成，TCA循环，糖酵解途径等相关代谢物也发生了变化（图3C）。图3SHH-MB肿瘤细胞的转录组重编程
三、肿瘤细胞EVs相关基因表达特征分析
之前的单细胞数据显示，许多在肿瘤细胞中上调的基因在胶质细胞以及免疫细胞中被激活，但是在对应健康组织的细胞类型中没有发生显著变化。而细胞外囊泡EVs是肿瘤细胞间进行代谢调控的重要因子，在SHH-MB肿瘤微环境中，EVs相关基因的相互激活可以反应细胞间基于EVs的信息传递。以MYC为例，作为一个重要的致癌基因，MYC能够通过肿瘤细胞分泌的大囊泡传递至基质细胞并且发挥作用。之前已经证明肿瘤细胞中发生了转录组重塑，接下来作者将目光聚焦在这个过程中EVs发挥的功能和作用。通过研究发现，SHH-MB肿瘤细胞中上调的差异基因与Vesiclepedia数据库中topEV蛋白能够发生重叠。在肿瘤胶质细胞（cluster7）和免疫细胞(cluster8)中不仅可以检测到Cd9，Cd81以及Cd63等编码跨膜蛋白的相关基因发生过表达，而且Atp5b,Npm1以及Ran等EVs基因在largeoncosomes中也发生了富集(图4A)。单细胞转录组分析结果显示，在肿瘤细胞中表达量上调的基因，在其周围的胶质细胞以及免疫细胞中同样会被激活，推测肿瘤微环境中EVs可能在其中发挥作用。在SHH-MB细胞中，差异上调的基因与前列腺癌细胞largeoncosomes的蛋白质组分析结果可以达到89%的重叠度（图4B）。其中，大部分重合的基因或者蛋白，比如Gapdh/GAPDH，Ldhb/LDHB，Mdh1/MDH1以及Tkt/TKT等，都参与了代谢调控的相关通路（图4C）。为了证明MB肿瘤微环境的改变是由于EVs介导造成的，作者将小鼠髓鞘相关胶质细胞Oli-neu分别与两种MB肿瘤细胞（MB1细胞以及D细胞）在transwell小室中共培养(图4D)，由于膜具有通透性，可以允许EVs分子通过其中，以相同条件下单独培养的细胞系作为对照。之后进行RNA-seq测序。结果发现在肿瘤细胞的调控网络中，代谢物发生了显著的改变（图4E），在D/Oli-neu共培养体系中，前者以及后者分别有以及个差异基因，MB1/Oli-neu的共培养体系中分别有个以及个差异基因，证明了不同细胞类型之间表达谱确实发生了改变，而这种改变与EVs密切相关。同时通过电镜图片，可以直观看到D细胞质膜上有EV分子的释放（图4F），同样在MB1细胞系以及Daoy细胞系(人SHH-MB型髓母细胞瘤)也有相同的现象。以上结果说明，肿瘤微环境中基因表达情况的改变是由于EVs介导造成的，EVs可以在肿瘤微环境中不同细胞亚群之间进行信息的传递。图4肿瘤细胞EVs相关基因表达特征分析
四、细胞外囊泡分子表达标签EVS构建
基于以上结果，作者构建了一个细胞外囊泡相关基因表达标签—ExtracellularVesicleSignature（EVS），其中共包括38个基因。EVS的筛选的标准主要包括：（1）相比于正常小脑细胞，在肿瘤细胞亚群中显著高表达的基因，且表达量排名在top20%之内；（2）与前列腺癌肿瘤largeoncosomes泡的基因标签重合，或者功能上相关；（3）通过基因功能网络分析，能够在调控网络中与其他EV家族分子相互关联，或者与肿瘤的发生过程等相关（图4E）。通过对ICGC队列中例患者数据的分析，作者发现不同亚型的EVS具有不同的特征，其中SHH以及Group3亚型的EVS呈现高表达的特点（图5A）。接着，在MAGIC队列中扩大亚型数以及样本数（例患者）进一步进行了验证，结果发现在12个亚型中，SHH-alpha以及G3-gamma中EVS表达量最高（图5B，5C）。图5细胞外囊泡分子表达标签EVS构建
五、EVS可以作为MB预后诊断工具
为了确认高表达的EVS与高风险MB患者的关联，作者分析了EVS表达情况与MYC扩增以及患者死亡率之间的关系，结果显示三者之间呈现正相关关系（图5D）。同时EVS与MB的转移也具有相关性，尤其是在Group3以及Group4亚型的患者，可以辅助高风险患者的判定（图5E）。EVS可以作为不同亚型之间的高风险MB患者的一个独立诊断指标（图6A），在ICGC以及MAGIC的队列中，EVS表达的差异会造成患者生存率的不同（图6B），这种影响在Group3以及Group4亚型中最为显著（图6C）。图6EVS能够辅助MB的预后诊断
研究结论
1.单细胞测序揭示SHH-MB型髓母细胞瘤中的代谢重塑过程。2.作者发现在MB肿瘤细胞，EVs可以作为载体调控不同细胞亚群之间的通讯，同时开发了一个细胞外囊泡相关基因表达特征—EVS。3.在四种MB亚型中,EVS的高表达与肿瘤的转移具有相关性，提示其可以作为识别高风险MB患者的一个评估指标，同时EVS表达的差异会造成患者生存率的不同，这种影响在Group3以及Group4亚型中最为显著。研究意义
EVs相关基因的表达激活可能反映组织微环境中细胞之间基于EV的信息转移，作者利用单细胞测序，通过细胞共培养后检测受体细胞表达变化以及电镜实验，证明了EVs确实可以调控不同细胞亚群之间的通讯，并且开发了一个新的分子工具—细胞外囊泡相关基因表达特征—EVS，能够用于鉴别不同亚型之间的高风险患者，同时高表达的EVS可以作为Group3以及Group4亚型患者预后的风险评估指标。结语
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本文编辑：佚名
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