缺氧微环境可诱导GCA中HIF1和EPAS1的表达。在肿瘤发展过程中，EPAS1抑制HIF1的表达，导致主要表现为抑制HIFs从HIF1转变为EPAS1。LncRNAZFAS1与EPAS1结合，促进HIF1抑制、EPAS1上调以及HIF1向EPAS1的转换。
ThehypoxiamicroenvironmentinducestheexpressionofHIF1andEPAS1inGCA.Duringtumordevelopment,theEPAS1suppressestheexpressionofHIF1,resultinginthedominantformofHIFsswitchingfromHIF1toEPAS1.LncRNAZFAS1bindstoEPAS1,facilitatingtheHIF1suppression,EPAS1up-regulation,andtheswitchingfromHIF1toEPAS1
LncRNA(长非编码RNA)ZFAS1(锌指反义1)在包括胃癌在内的多种癌症中起癌基因的作用。然而，其在胃癌最具侵袭性的贲门腺癌(GCA)中的作用及其机制尚不清楚。我们在这里证明了lncRNAZFAS1在GCA组织中上调。此外，ZFAS1水平升高与GCA转移和肿瘤复发显著相关。它也被证明是GCA患者无病生存期和总生存期的独立预后指标。RNA测序显示，上调的ZFAS1与下调的缺氧诱导因子1(HIF1)和上调的EPAS1(内皮PAS结构域蛋白1，又称HIF2)密切相关。体外研究表明，ZFAS1能与EPAS1结合，增强其与EPAS1结合的能力。在表观遗传学上沉默HIF1，并促进其在GCA细胞系中的表达。在动物模型中，共转染EPAS1和ZFAS1反义寡核苷酸可显著增强其对肿瘤生长的治疗作用。因此，靶向ZFAS1和EPAS1可能是GCA的另一种治疗选择。
2.Introduction贲门腺癌(GCA)是胃癌中最常见和最具侵袭性的类型，也是世界上最常见的癌症之一[1，2]。非贲门腺癌的发病率和死亡率在过去几十年中显著下降，与之不同的是，GCA在发展中国家和发达国家的发病率都有所上升[1-6]。手术是GCA患者唯一有效的治疗方法[7]。遗憾的是，术后复发转移率在50%左右，预后差，生存率低[4，8-10]。因此，迫切需要揭示GCA的潜在机制并确定新的治疗靶点。LncRNA(长非编码RNA)ZFAS1(锌指反义1)作为癌基因在多种癌症中发挥作用，包括胃癌[11，12]。已有研究表明，lncRNAZFAS1通过靶向microRNA-b-3p/WNT1通路和表观基因抑制KLF2和NKD2[13，14]，促进胃癌的恶性进展。此外，在不同肿瘤中也发现了许多其他靶点，如胶质瘤中的miR--5p，鼻咽癌中的miR-a，结直肠癌中的miR-7-5p，miR-，miR--5p/VEGFA[17-19]，骨肉瘤中的miR-/NOB1通路和miR-，骨肉瘤中的miR--5p/RAB9A。MIR-用于膀胱癌[25]，miR-用于前列腺癌[26]。然而，LncRNAZFAS1在GCA中的表达谱和机制尚不清楚，因此，我们认为上调的LncRNAZFAS1在GCA中可能是一个独立的预后指标。ZFAS1可通过EPAS1在GC细胞中协助HIF1的表观遗传沉默，从而促进癌细胞的增殖和转移。因此，靶向ZFAS1和EPAS1可能是GCA的另一种治疗选择。
在这里我查了一下ZFAS1相关的文献有多篇,师兄的这篇文章是年发的.说明也有文献阅读然后参考别的文章的情况
3.Methodsandmaterials病人这一块
1年至9年，名患者。组织学特征均为GCA.所有GCA患者在样本采集前均未接受任何抗癌治疗。排除第二原发灶或原发灶不是GCA的患者。手术后1小时内，收集所有样本。收集距GCA组织5cm以上的邻近正常组织。一半的标本立即冷冻并储存在液氮中，直到RNA和蛋白质提取出来。另一半用福尔马林固定进行组织学分析。
RNA-QRTPCR
TotalRNAwereisolatedbyusingtheTRIzolreagent(ThermoFisherScientific)andthecDNAwaspreparedwiththeiScriptTMcDNASynthesiskit(Bio-Rad,USA)accordingtothemanufacturer’sprotocols.TheRT-qPCRwasperformedwiththeSYBRGreenPCRkit(Bio-rad,USA)onthefastReal-TimePCRsystem(AppliedBiosystems,USA).RelativemRNAlevelsoftargetgeneswereassessedbythe2?DDctmethodwhiletheGAPDHwasusedasinternalcontrol.Thefollowingprimerswereused:ZFAS1forward,50CTATTGTCCTGCCCGTTAGAG-30andreverse,50-GTCAGGAGATCGAAGGTTGTAG-30.PrimersformeasuringtheHIF1andEPAS1weredemonstratedbefore
TRLZOL法,逆转录没有说上样多少RNA,内参用的GAPDH,引物我自己会设计
Westernblotting
cellculture
新鲜分离的人GCA细胞系GCA-H和GCAL在DMEM(GIBCO)+10%胎牛血清(GIBCO)中培养。将人ZFAS1转录本1cDNA插入到pCDNA3.1中。生物素标记ZFAS1用PierceTMRNA30EndBiotinylationKit(ThermoScience)按说明书制备。用siRNA(靶序列5-AAGTGAAGATCTGGCTGAACCAGTT-3)敲除ZFAS1。HIF1和EPAS1过表达或下调，如前所述[29]。按照说明用脂质体0(ThermoScience)转染细胞。在低氧和常氧实验中，细胞在低氧(2%O2)和常氧(21%O2)条件下培养72h，低氧培养箱由低氧培养箱和单流量仪(干细胞技术)组成。
这个细胞是什么鬼,从病人身上养出的原代?
Lentiviruspreparation(慢病毒,我想学学)
TheshRNAforLncRNAZFAS1(targetsequence50-AAGTGAAGATCTGGCTGAACCAGTT-30)andEPAS1[29]wereclonedintolentiviralpLKO.1-purovector,andtheemptyvectorasnegativecontrol.LentiviruseswerepreparedusingHEKTcellsaccordingtothemanufacturer’sinstructions.GCA-Hcellswereincubatedwithlentivirusand4mg/mLpolybrene(AmericanBio)for24hr
Cellviability,apoptosis,migrationandinvasionanalysis
细胞活性、凋亡、迁移和侵袭分析
细胞活力测定采用CCK-8(Beyotime，中国)。细胞凋亡检测采用AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒(ThermoScience)进行流式细胞仪检测。创伤愈合实验测定细胞迁移。细胞培养在12孔板中，80%~90%融合。用塑料吸管尖端制作伤口线后24h，倒置显微镜下记录细胞迁移情况。
用ImageJ软件对图像进行分析。细胞迁移百分率计算为(1-剩余无细胞面积/初始创面面积)？。细胞总数计数显示，在细胞迁移实验的所有条件下，细胞以相似的水平增殖。用Transwell系统(Corning)进行细胞侵袭。将6.0-细胞接种于跨孔膜上表面48h后，对向跨孔膜下表面迁移的细胞数量进行定量。细胞总数计数显示，在细胞侵袭实验的所有条件下，细胞以相似的水平增殖。
Chromatinimmunoprecipitation(ChIP)
Animalstudy
Statisticalanalysis
数据以平均值(±SE)表示，并用SPSS软件包(SPSSInc，USA)进行分析。用卡方检验评估变量间的差异。生存分析采用Kaplan-Meier分析。采用对数秩检验比较不同生存曲线。变量的单变量和多变量风险比由Cox比例风险模型确定。采用非配对t检验和单因素方差分析进行统计学处理。P值小于0.05被认为具有统计学意义。
可以看到一篇6分的文献还是有相当多的内容的.同志仍需努力啊!
4.ResultsTheLncRNAZFAS1wasup-regulatedinhumanGCA
总共对名GCA患者进行了临床随访(表1)。LncRNAZFAS1的mRNA水平被定量，与配对的邻近非肿瘤组织相比，其在GCA组织中的表达上调(图1A)。
然后，根据lncRNAZFAS1mRNA与内对照GAPDH的相对水平将患者分为两组。分别为低lncRNAZFAS1组(lncRNAZFAS1mRNA水平低于GAPDH)和高lncRNAZFAS1组(lncRNAZFAS1mRNA水平高于GAPDH)。结果表明，高表达的LncRNAZFAS1与肿瘤分化程度、TNM分期、远处转移或复发密切相关(表1)。进行总生存期(OS)和无病生存期(DFS)分析，以确定LncRNAZFAS1水平是否可作为预测肿瘤转移或复发的指标。数据显示，LncRNAZFAS1水平高的患者最终发生转移或复发的几率更高(图1B，表1)。此外，单因素分析还表明，LncRNAZFAS1水平高的患者DFS和OS显著降低(表2)。
多变量multivariateanalysis结合临床病理参数分析表明，高水平的lncRNAZFAS1是预测肿瘤复发或转移发生率的独立预后指标(表3)。因此，上调的lncRNAZFAS1可能与GCA的发生和不良结局有关。
在这里提到了单因素和多因素分析,(应该是单因素和多因素分析).下个目标就是学会单因素和多因素分析
ThehypoxiainduciblefactorswereregulatedbytheLncRNAZFAS1
低氧诱导因子受lncRNAZFAS1调控
为了揭示LncRNAZFAS1调控的潜在靶点或途径，对5例高ZFAS1组和5例低ZFAS1组的临床标本进行了RNA测序。聚类分析表明，两组均有大量差异表达基因(图2A，表S1)。在高ZFAS1组和低ZFAS1组的前10个差异表达基因中，EPAS1在高ZFAS1组高表达，HIF1a在低ZFAS1组高表达(表S1)。EPAS1，又称缺氧诱导因子-2a(HIF2A)，与HIF1a(由HIF1a基因编码)是两个重要的缺氧诱导转录因子。(算是背景知识的积累吧)
此外，已经证明EPAS1可以在表观遗传上沉默HIF1a的表达，从而导致肾癌的肿瘤形成[29]。因此，我们想知道HIF1-EPAS1开关是否在lncRNAZFAS1相关的GCA中也起着重要作用。事实上，与邻近的非癌组织相比，GCA组织中EPAS1的mRNA水平上调，而HIF1a保持不变(图2B)。然而，与低ZFAS1组相比，高ZFAS1组GCA组织中HIF1a表达下调，而EPAS1表达上调(图2B)。然后，用Westernblot进一步证实了这一表达模式(图2C)。因此，LncRNAZFAS1的表达水平可能影响HIF1a和EPAS1的表达，而HIF1a和EPAS1是肿瘤发生发展过程中的重要调节因子。
图2.HIFs和lncRNAZFAS1的表达水平密切相关。(A)对LncRNAZFAS1高表达或低表达的GCA的mRNA谱进行系统聚类分析。(B)用RT-qPCR方法检测癌组织、癌旁正常组织(上面板，n=)、高(下面板，n=)和低(下面板，n=)组织中HIF1a和EPAS1的mRNA水平。结果用框图表示；中线表示中位数；框的底部表示第25个百分位数；框的顶部表示第75个百分位数。(C)免疫印迹法检测低(L，n=3，生物三重)和高(H，n=3，生物三重)lncRNAzFAS表达水平的GCA组织中HIF1和EPAS1的蛋白水平。N.S.：无显著差异；*P0.05。两组比较采用非配对t检验
LncRNAZFAS1facilitatedtheepigeneticsilencingofHIF1A
已经证明EPAS1可以在表观遗传上沉默HIF1a的表达，导致肾癌的肿瘤形成[29]。我们的数据表明，lncRNAZFAS1可能降低HIF1a的表达，而上调EPAS1的表达(图2B和C)。因此，我们从GCA患者的两个新分离的GCA细胞系GCA-H和GCA-L中研究了lncRNAZFAS1在调节HIF1-EPAS1开关中的作用。GCA-H细胞系从高水平的lncRNAZFAS1患者中分离得到。GCA-L是从低水平的lncRNAZFAS1患者中分离出来的.
慢病毒表达LncRNAZFAS1增加了两个细胞系中ZFAS1的mRNA水平(图3A)。而lncRNAZFAS1的过表达降低了HIF1的蛋白水平，上调了EPAS1的表达(图3B)。已有研究表明，在癌症早期，HIF1的形成以稳定为主，这限制了增殖，但后来EPAS1增加，这诱导了更具侵略性的细胞行为[29]。HIF1和EPAS1都通过直接与HIF1a近端启动子中的反向缺氧反应元件结合来下调HIF1的mRNA水平[29]。这种结合激活了一系列抑制性组蛋白修饰标记，包括组蛋白3赖氨酸27三甲基化(H3K27me3)，使变化稳定，如果被推翻，则由于HIF1表达水平过高而抑制癌细胞的增殖[29]。在目前的研究中，我们的数据表明HIF1a的启动子区域更受lncRNAZFAS1过表达的表观遗传抑制(图3C)。因此，lncRNAZFAS1可能促进了HIF1a的表观遗传沉默。
这里师兄用了chip芯片,证明了lncRNA的这个结构域和某些地方有一定作用.大概就是这样
Fig.3.LncRNAZFAS1facilitatedtheepigeneticsilencingofHIF1A.(A)Lentiviralover-expressionofLncRNAZFAS1wasconfirmedbyRT-qPCR.(B)WesternblotshowedtheproteinlevelofHIF1andEPAS1afterlentiviralover-expressionofLncRNAZFAS1.(C)ChIPanalysisofH3K9me3,H3K27me3,andH3K4me3onHIF1ApromoterinGCAcellswithorwithoutoverexpressingtheLncRNAZFAS1viaRT-qPCR.NC:negativecontrol;GCA-H:freshisolatedGCAcelllinewithhighlevelofLncRNAZFAS1;GCA-L:freshisolatedGCAcelllinewithlowlevelofLncRNAZFAS1;*P0.05.TheunpairedStudent’sttestwasusedfortwogroups
本文编辑：佚名
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