近10年来，以表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)作为IE点所代表的非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer，NSCLC)个体化治疗，取得了极大的成功，EGFR突变的晚期NSCLC接受EGFRTKI治疗，中位总生存时间已达24?30个月。目前的研究热点在于如何克服EGFR靶向治疗的耐药。EGFR-TKI耐药机制包括:20外显子TM突变、原癌基因MET扩增和过表达等。本文就EGFR突变NSCLC中原发和继发性c-MET信号通路改变所引起的耐药研究进展进行综述。
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1.HGF/c-MET的结构
c-MET是一类具有自主磷酸化活性的跨膜受体，属于酪氨酸激酶受体（receptortyrosinekinases，RTKs)超家族成员。编码该受体的基因位于7号染色体q21-31区，大小约llOkb，包括21个外显子。c-MET受体由50kD的a链和kD的P链组成的异二聚体，包括sema(semaphorins),PSI(plexins，semaphorins，integrins),4IPT重复区域(immunoglobulins，plexins，transcriptionfactors),TM(transmembrane),JM(juxtamembrane),和TK(tyrosinekinase)保守蛋白区域。胞外氨基末端个残基折叠成一个大的senrn区域，为与配体结合及受体二聚化所必需的重要结构。PSI区域紧接在serrm区域后面，大约有50个残基和4个二硫键，这个区域通过四个IPT区连接到跨膜螺旋。在细胞内，c-MET受体包含一个酪氨酸激酶催化域，有4个关键的调节酶活性的酪氨酸残基，形成几个信号传导蛋白的停泊位点，进而导致生物应答。c-MET最先是从人骨肉瘤衍生出的细胞系中分离出来的，随后发现主要是在上皮细胞上表达。在胚胎发育和成年时期，很多器官上皮细胞表面表达c-MET受体，包括肝、胰腺、前列腺、肾脏、肌肉和骨髓。
HGF是c-MET的唯一配体，最先作为促进肝细胞分裂的物质被发现，随后证实其和分散因子是同一种物质(scatterfactor，SF)，可以诱导上皮细胞分裂。HGF主要来源于间质细胞，以旁分泌的形式作用于表达c-MET受体的上皮细胞。编码HGF的基因位于7号染色体q21区，大小约70kb，包括18个外显子和17个内含子。HGF前体是由间质细胞分泌，由个氨基酸残基组成的单链，在蛋白水解酶的作用下产生活性形式，成熟的HGF是由96kDa的a链和34kDa的P链经二硫键连接组成的异二聚体。HGF含6个结构域，分别为氨基末端结构域、4个Kringle结构域及SPH结构域(serineproteinasehomology，SPH)。HGF/c-MET具有多种生物学功能，可以促进细胞增殖、生长、运动、分散、分化和形态发生。
2.HGF/c-MET信号通路
当c-MET与其配体HGF结合后，触发受体二聚化和转移磷酸基，胞质中酪氨酸残基(Tyrl、Tyr)可发生自身磷酸化，从而激活c-MET胞质内蛋白激酶结构域中酪氨酸激酶(phosphotyrosinekinase，PTK)，激活的PTK可引起c-MET竣基末端酪氨酸(Tyrl、Tyrl)的自身磷酸化。c-MET激活招募衔接蛋白Gabl和Grb2、激活Shp2、Ras和ERK/MAPK，细胞质中的多种效应蛋白募集到磷酸化的羧基末端并被快速磷酸化，最后激活细胞内多种信号通路，如phosphoinositide3-3-kinase(PI3K)/AKT、Ras-Rac/Rho、mitogen-activatedproteinkinase(MAPK)及Stat3通路等，促进细胞变形、增殖、抗凋亡、细胞分离、运动和侵袭。
正常的HGF/c-MET信号通路在不同细胞、不同分化阶段参与多种生理过程，如胚胎发育过程中控制细胞的迁移，组织损伤后的修复等。c-MET表达的异常调节有过表达、组成的激酶激活、基因扩增、通过HGF旁分泌和自分泌激活、c-MET突变以及后继的改变。虽然在大部分肿瘤中c-MET扩增的发生率一般较低（1%)，但是NSCLC的发生率可达2%?4%，c-MET基因扩增，导致蛋白过表达和激酶激活。到目前为止，HGF/c-MET通路最常见的失调机制是过表达，可通过c-MET基因扩增或者通过扩增依赖性途径提高c-MET表达水平。c-MET过表达的肿瘤中，c-MET可以不依赖HGF被激活。异常的HGF/c-MET信号通路在肿瘤发生发展中起非常重要作用，能诱导肿瘤的生长、侵袭和存活。
3.HGF/c-MET信号通路的异常
3.1c-MEr突变
c-MET突变激活激酶或者使激酶对刺激髙度反应，改变活化程度或者蛋白有效降解，进而延长生物化学信号的持续时间。突变可以发生在胞外和胞浆区域。在遗传性乳头状肾癌中第一次发现c-MET激酶区突变。对肺癌和其他实体瘤外显子的系统性分析显示cMEr突变主要发生在sema和JM区域。
sema区域突变
c-MET的胞外sema区由外显子2编码，为HGF结合提供特定的位点。突变分析显示该区域是受体激活和二聚化所必需的。7%胸膜间皮瘤发生该区域突变(NS、MV和NI)，但是这些突变在细胞恶性转化中的作用仍不详。研究报道肺癌sema区域种系存在突变,例如，在亚裔和高加索肺癌患者中检测到NS突变,但是在非裔美国肺癌患者中没有发现该突变。在肺癌,NS更常见于鳞癌而非腺癌或大细胞癌。sema区域突变导致c-MET与HGF亲和力不同,体外研究显示NS突变可能导致对MET抑制剂耐药。
JM区域突变
JM区域具有特征的功能获得性突变是受体酪氨酸激酶FLT3。FLT3出现在大约20%急性髓性白血病患者中,可以调节FLT3激酶的催化活性。在急性髓性白血病中发现c-MET的JM区域TI突变，尽管急性髓性白血病的发生通常与JM区域c-MET突变可能无关。JM区域c-MET突变的Rottweiler狗发生癌症的风险增加。74%Rottweiler狗携带功能获得的METGS种系突变，更容易发生淋巴瘤、骨肉瘤和组织细胞肉瘤等恶性肿瘤。一些JM区域突变加快人恶性肿瘤的形成而不是完全转化为恶性肿瘤。例如c-MET-TI突变和MET激酶激活不完全相关,然而，无胸腺的裸鼠接种表达C-MET-TI的NIH3T3细胞系比c-MET野生型细胞系更快发生恶性肿瘤。除了TI突变外,在例肺腺癌患者中发现RC和TA种系突变,可能与肺癌发生有关。SCLC组织样本和细胞系的突变分析显示JM区域发生RC，TI和SP突变。RC突变出现在非裔美国人和高加索肺癌患者中,但罕见于非亚裔患者。体外实验显示这些改变促进肺癌发生、细胞迁移和c-MET蛋白磷酸化。活性氧(reactiveoxygenspecies,ROSs)水平增加可能和RC和TI改变相关。很多肿瘤细胞中R0S来源于线粒体，传导癌症信号通路,促进基因组不稳定。
激酶区域突变
c-MET激酶区域活化是信号传导和生物应答所必需的。c-MET激酶区域突变并不常见，并且大部分c-MET激酶区域的激活突变发生在散发的乳头状肾癌(体细胞)和遗传性乳头状肾癌(种系）中。这些突变导致c-MET激酶活性增加，促进细胞运动和肿瘤转移。尽管很多研究致力于发现编码c-MET基因所有外显子的其他突变，但是可以推测小分子酪氨酸激酶抑制剂如BCR-ABL和其他激酶诱导治疗的使用可能导致c-MET激酶区域的再次突变。
3.2c-MET基因扩增
c-MET基因扩增可以激活c-MET受体。10%~20%人胃癌细胞中检测到c-MET基因扩增，1扩增显示出对MET抑制剂治疗敏感。
断裂-融合-桥接(breakage-fusion-bridge，BFB)机制被认为是导致c-MET基因扩增的主要原因[3。在NSCLC中，c-MET基因扩增和paxillin表达显著相关，而paxillin是一种局灶吸附蛋白参与细胞骨架功能的调节。因为c-MET基因扩增使得细胞出现恶性转化,可以想象c-MET基因扩增可能导致其他癌基因转化的肿瘤出现治疗耐药。研究证实c-MET基因扩增是EGFR突变肺癌对EGFR小分子抑制剂耐药的机制。
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3.3C-MET蛋白过表达
c-MET过表达可以导致肿瘤形成。升高的c-MET蛋白水平和c-MET信号通路的功能激活可以转化正常成骨细胞。体外研究发现,c-MET过表达导致人成骨细胞转化为骨肉瘤细胞,体内产生骨肉瘤样疾病。肝细胞过表达c-MET可以诱导转基因鼠发生肝细胞肝癌。Ichimura等研究发现c-MET过表达出现在38.5%(20/52)鳞癌,72.3%(34/47)腺癌以及研究的全部11种NSCLC细胞系中。与邻近正常肺组织相比,NSCLC中c-MET蛋白表达水平通常升高2-10倍,HGF水平升高10-倍。许多蛋白质和c-MET蛋白表达相关，在神经内分泌肿瘤中，下游靶点paxillin和转录因子Pax5与c-MET和/或磷酸化c-MET共同表达。在肺癌易感性和肿瘤发展中，并不需要HGF和c-MET同时表达异常。HGF转录调节了解得很少,但是已经发现增加c-MET表达的几个关键因素，例如缺氧可以诱导c-MET表达,并且增加依赖HGF的侵袭性在结直肠癌中,c-MET表达上调可能是Wnt信号通路调控的早期事件气转录激活因子的Pax家族成员是调节c-MET蛋白表达的重要因子。在肢体肌肉发育过程中，Pax3和Pax7通过独特的机制调节c-MET表达。在肺癌,PAX5表达于SCLC,而PAX8表达于NSCLC在SCLC中,PAX5是c-MET的转录因子，并且在细胞核中发现激活的c-MET。可能有组织和谱系特异的其他因子调节c-MET表达。
检测c-MET蛋白表达的方法是免疫组织化学染色(immunohistochemistry,IHC)。随着使用IHC染色的强度标准不同,文献报道的MET表达率不同。一种IHC染色的方法分为0-3。根据染色阳性的肿瘤细胞百分比,染色程度计分0~%,最终得分是这两种计分的和。肿瘤组织最终计分认为是阴性，得分3认为是阳性。Sun等报道在非选择性的NSCLC(n=)中，c-MET阳性率为67.2%[43]。Huang使用H-SCore系统染色计分方法半定量分析c-MET免疫反应性。染色强度得分和之前的文献描述相同,但是每个强度阳性百分比用百分率计算。H-score是强度得分和得分百分率的乘积，得分范围0~。结果显示NSCLC(n=)中，c-MET过表达的发生率为51%。
4.c-MET与EGFR-TKI耐药
EGFR-TKIs巳经成为EGFR突变的NSCLC患者一线标准治疗,延长了患者无进展生存期(Ptogression-Free-Survival,PFS),改善了患者生活质量。但几乎所有的EGFR突变患者最终会对EGFR-TKIs治疗产生获得性耐药。
4.1c-MET与EGFR-TKI获得性耐药
EGFR-TKIs获得性耐药的主要机制有EGFR-TM突变、c-MET基因扩增或者表达,其中c-MET基因扩增占5%~22%。Engelman等认为，EGFR突变型肺癌细胞依赖于其自身激活的、通过ErbB3介导的PI3K/Akt信号通路而增殖并成瘾；Gefitinib诱导的细胞凋亡通过下调该通路而实现。该研究组构建了一株开始对Gefitinib敏感但暴露在递增浓度的Gefitinib6个月后产生了耐药克隆的细胞株。他们发现这一耐药归因于c-MET原癌基因的扩增,对c-MET通路的抑制可恢复其对Gefitinib的敏感性；同样，c-MET扩增导致的Gefitinib耐药通过以ErbB3介导的PI3K的持续激活，从而绕过了Gefitinib作用的靶点EGFR。为了确认相关发现的临床意义，他们进一步分析了18例Gefitinib/Erlotinib获得性耐药患者的肿瘤标本，22%(4/18)的患者检出c-MET扩增。在获取服药前后配对肿瘤标本的8个病人中，2例患者治疗前并不存在的c-MET扩增在，但出现在Gefitinib/Erlotinib获得性耐药之后。
4.2C-MET与EGFR-TKI原发性耐药
Benedettini等检测EGFR突变的NSCLC患者在使用EGFR-TKI治疗前c-MET状态，10例EGFR突变的患者中有2例肿瘤中检测到c-MET蛋白表达和磷酸化，对随后的EGFR-TKI治疗疗效差，表现为对EGFR-TKI原发耐药。该研究表明EGFR突变NSCLC患者在接受EGFR-TKI治疗前存在c-MET激活，c-MET可能涉及EGFR-TKI原发耐药机制。Turke等使用高流通量的FISH分析细胞系和患者c-MET状态，结果发现在接受EGFR-TKI治疗前已经有c-MET扩增的细胞亚群存在。在接受EGFR-TKI治疗前或者对EGFR-TKI产生获得性耐药前，EGFR和c-MET可能协同促进肿瘤形成，HGF加速c-MET扩增的发展。c-MET扩增在EGFR突变肺癌激活ERBB3/PI3K/AKT信号通路从而导致对EGFR-TKI治疗耐药。HGF激活c-MET通过GAB1信号通路也导致耐药的发生。不管是c-MET扩增还是自分泌的HGF导致的EGFR-TKI耐药，都可以通过联合抑制EGFR和c-MET来克服。c-MET激活的EGFR突变NSCLC可能从早期的联合抑制EGFR和c-MET治疗中获益。单纯抑制c-MET或EGFR都不足以完全阻断EGFR-TKI耐药细胞系的信号传导。
总之，c-MET扩增通过激活EGFR非依赖的HER-3以及下游PI3K/AKT下游信号通路的磷酸化促进细胞对EGFR-TKI原发或继发耐药，而抑制c-MET阻断HER-3/PI3K/AKT激活，可以恢复EGFR-TKI的敏感性。需要一种新的方法来治疗EGFR-TKI获得性耐药，也要识别未接受EGFR-TKI治疗前就已经携带c-MET扩增的EGFR突变NSCLC，这些患者可能从起始的联合抑制c-MET和EGFR的治疗中获益。
5.C-MET与EGFR突变型NSCLC预后
Cappuzzo等利用FISH技术对例NSCLC术后标本进行检测，发现c-MET基因拷贝数5的患者48例(11.1%)，单变量分析发现c-MET基因拷贝数高的患者预后较差(HR=0.59，95%CI:0.41?0.85，P=0.)，多变量模式分析也显示c-MET基因拷贝数髙的患者死亡风险髙(HR=0.66，95%GI：
0.43-0.99,P=0.04)。该研究进一步分析EGFRFISH阴性(n=)患者亚组中，c-MET基因拷贝数5(n=15)的患者总生存时间较短（中位生存期:22.6个vs.55.9个月,P=0.)。在EGFRFISH阳性(n=)患者亚组中，c-MET基因拷贝数5(n=15)的患者总生存时间较短（中位生存期，28.9个月vs.42.6个月，P=0.2)，但是差异没有达到统计学意义[气Huang等的研究发现，72例EGFR野生型患者c-MET过表达者(n=37)总生存差于c-MET阴性患者(29.8个月vs.69.1个月，I2=7.,P=0.)。然而在30例EGFR突变患者中，c-MET过表达患者U=17)总生存略短于c-MET阴性患者，但是差异没有统计学意义(35.0个月vs.35.9个月，P=0.)。多因素分析显示c-MET过表达是EGFR野生型NSCLC患者预后差的独立因素，但在EGFR突变NSCLC患者中没有这种趋势。
综上所述，这些研究提示c-MET可以作为判断NSCLC患者预后的一个重要标志物，其预后价值可能依赖EGFR突变状态的不同而不同。若c-MET表达或基因扩增数高于正常，则患者预后较差，特别是EGFR野生型患者。
6.靶向C-MET治疗
6.1C-MET作为駆基因的靶向治疗
Tivantinib
Tivantinib(ARQ-)是美国ArQule公司与日本DaiichiSankyo等公司联合研发的非ATP依赖的c-MET抑制剂。Tivantinib对未活化的c-MET具有较强的选择性抑制作用，并且可抑制c-MET的自身磷酸化。TivantinibII期临床试验比较了Tivantinib联合erlotinib对Tivantinib联合安慰剂的疗效。共入组例NSCLC患者，实验组84例，其中54%为腺癌。研究结果显示:两组无进展生存期分别为3.8个月和2.3个月（HR=0.81，95%CI：0.57-1.16,P=0.24),总生存期分别为8.4个月和6.8个月(HR=0.88,95%CI：0.6-1.3,P=0.50)。在病理类型为非鱗癌患者中，无进展生存期分别为4.3个月和2.2个月（HR=0.71,95%GI：0.46?1.1，P=0.12)，总生存期分别为9.9个月和6.8个月（HR=0.72，95%CI:0.6?1.3，P=0.18)。在此基础上，研究者设计了Tivantinib的HI期临床试验MARQUEE,拟入组0例非选择的晚期非小细胞肺癌2?3线治疗，年的中期分析发现不能达到OS的终点指标而提前终止该试验。年ASC0报道了ATTENTION研究结果，厄洛替尼联合tivantinib组有14例患者(其中3例死亡)发生间质性肺炎，而厄洛替尼联合安慰剂组有6例(没有一例出现死亡)发生间质性肺炎。因为两组间观察到的不均衡的间质性肺炎的发生率，该研究入组到例患者而提前终止。虽然该研究缺乏统计学检测效率，但是研究显示联合治疗组OS数值上有延长，但是未达到统计学差异，中位OS为12.9个月vs.11.2个月，HR0.，P=0.。Tivantinib的研究提示了一个不容回避的问题，为什么一个号称针对cMET的抑制剂，在Ⅲ期临床试验的研究对象却是非选择人群？
Crizotinib
Crizotinib最初的研发是针对c-MET的小分子酪氨酸激酶抑制剂，其机制主要是通过抑制c-MET激酶与ATP的结合及两者结合之后的自身磷酸化而发挥作用。Ou报道1例存在c-MET扩增而无ALK融合基因的NSCLC患者使用Crizotinib后获得快速持续的缓解，提TKCrizotinib在临床上可能作为一种c-MET抑制剂。Camidge等在年的ASC0大会上报道Crizotinib在晚期c-MET扩增的NSCLC中的疗效和安全性，使用FISH检测c-MET扩增状态，入组患者按MET/GEP7比率分为三组：1.8?2.2(低)，2.25(中)和多5(高)。这项研究是一项正在进行的Crizotinib的I期研究中的一部分(NCT85195)。入组患者接受crizotinibmgBID治疗，截止到分析，共入组14例患者晚期NSCLC，其中低c-MET扩增2例(MET/CEP7S1.8?2.2)，中度cMET扩增6例(MET/CEP72?5)，高度扩增6例(MET/CEP)，低扩增者的有效率为0，中扩增者17%，高扩增者67%。75%患者出现治疗相关AES：最常见的是腹泻(50%)、恶心(31%)、呕吐(31%)、外周性水肿(n=25%)和视觉受损(25%),大多数为1度。该研究认为Crizotinib可以有效治疗c-Met扩增的NSCLC，耐受性好,毒副作用可以处理,需要进一步研究证实Crizotinib治疗c-MET扩增的NSCLC的疗效,并且探索MET/CEP7比和疗效的相关性。
MetMb
MetMb是美国基因泰克(Genentech)与罗氏(Roche)公司联合研发的抗c-MET单克隆抗体,其作用机制是阻止HGF与c-MET的结合及c-MET二聚体化，抑制HGF/c-MET介导的肿瘤生长。MetMb的Ib期临床试验显示出较好的安全性和耐受性，推荐剂量为15mg/kg每周一次。MetMb的II期临床试验主要是比较MetMb加厄洛替尼与安慰剂加厄洛替尼用于二线或三线治疗NSCLC的效果，该试验共入组例患者，随机分配入组,结果显示MetMb加厄洛替尼组PFS及OS并没有临床获益，然而,对于Met阳性肿瘤（IHC2+/3+)的患者，在厄洛替尼治疗基础上加用MetMb显著延长了患者的无进展生存期（PFS:HR0.53,P=0.04)和总生存期（0S:HR0.37,P=0.)。而MET阴性患者接受erlotinib联合MetMb治疗显示缩短的PFS(HR1.82，P=0.05)和0S(HR1.78,P=0.16)。在此基础上开展的MetMabIE期临床试验，却遭遇滑铁卢，年ASC0年会报道了该项研究结果，用cMET过表达选择患者进行MetMab联合erlotinib或MetMab联合安慰剂治疗，PFS和OS的差异均没有统计学意义,安慰剂甚至有更长生存的趋向。
6.2克服EGFR-TK丨耐药
Tivantinib
一项tivantinib联合厄洛替尼治疗EGFR突变NSCLCII期多中心单臂的临床研究,人组患者为EGFR-TKI治疗后疾病进展的NSCLC患者。共45例患者接受联合治疗,22例为c-MET高表达患者,客观反应率(objectiveresponserate,0RR)为9.1%(95%CI1.1-29.2),中位PFS为天(95%CI43-)；c-MET低表达患者22例，0RR%为0.0(95%CI0.0-15.4),中位PFS为43天(95%CI42~)；该研究发现在EGFR-TKI治疗耐药的EGFR突变NSCLC中，高c-MET表达或没有EGFR耐药突变的患者可能从厄洛替尼联合tivantinib治疗中获益。
Cabozantinib
一项cabozantinib联合厄洛替尼治疗EGFR-TKI治疗进展的EGFR-突变NSCLC患者的II期研究，从年5到年1月四个中心共人组37例患者,中位年龄63岁，63%女性，51%为PS0。4例患者获得PR(2例确认,2例未确认)，13例患者仍然接受治疗。20/23证实肿瘤生长受到抑制(倍增时间增加30%)。腹泻(10/35,29%)是最常见的3度AE,其他的3度AE有皮疹(6%)。4度AE包括恶心(1例)、脂肪酶升高(2例)、淀粉酶升高(1例)。相关研究正在确定疗效和MET扩增及TM突变的关系。该研究认为厄洛替尼和cabozantinib联合可以治疗EGFRTKI耐药的EGFR突变NSCLC患者。
INC
INC是一种高选择性的，口服MET抑制剂。临床前研究证实INC联合EGFRTKIs在MET激活EGFR突变NSCLC中有抗肿瘤疗效。一项单臂Ib/n期临床研究INC联合吉非替尼治疗EGFR突变MET阳性NSCLC安全性和有效性(临床试验编号:NCT)。该试验人组标准：年龄≥18岁，ECOGPS在2,EGFR突变NSCLC且EGFRTKI治疗耐药，MET异常(扩增FISH5CN或过表达IHC2/3+)。结果:46例患者人组(59%女性，中位年龄58y)。患者接受7个剂量组INC~mgqd和~mgbid,联合吉非替尼mgqd。2例患者出现剂量限制性毒性，表现为头晕(mgqd)和呼吸困难(mgbid)。最常见药物相关副作用有恶心(27%)、呕吐、腹泻和皮疹(22%)。3/4度药物相关不良反应:脂肪酶升高(7%)、淀粉酶升高(5%)。一例患者出现死亡，不能排除是否药物相关。6例患者(15%)PR患者均有MET高表达。结论:口服INC联合吉非替尼耐受性良好,初步的临床疗效支持进一步评估INC联合吉非替尼治疗MET阳性EGFR-TKIs耐药的NSCLC。
小结和展望
HGF/c-MET通路是肺癌领域活跃的一项研究，MET过表达和/或扩增在肺癌的发病机制的扮演重要角色。HGF/c-MET通路是未来肺癌靶向治疗的重要发展方向。除了肺癌,很多实体瘤都有c-MET激活，是否存在一类c-MET激活的肿瘤，这些肿瘤都可以从抑制MET治疗中获益呢？哪一种检测方法可以最佳最可靠地甄别获益患者，这些患者在临床和分子学方面有何特征，如何克服MET抑制剂获得性耐药,与何种药物联合治疗的方案最佳，这些都是未来临床医师面临的挑战。
军科基因——
与临床专家紧密配合，把握基因科学最新进展，推动中国肿瘤个体化诊治进程。
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