研究方法培训
非编码RNA与外泌体研究策略及数据分析实战研讨会（10月24-29） 年10月24-29年9月美国德科尼尔研究所学者AyukoHoshino于Cell发表研究性文章ExtracellularVesicleandParticleBiomarkersDefifineMultipleHumanCancers，其研究对来自个人类样本的胞外囊泡和颗粒(EVPs)进行全面的蛋白质组分析，确定了panEVP标记，用于分离EVP的生物标记，从而用于癌症检测和确定癌症类型。
病理学家通常采用组织活检来诊断癌症、癌症扩散和测量治疗效果。同时，液体活检是微创的，可以连续进行，可以在更早的时候发现癌症，更容易治愈。随着液体活检技术用于早期癌症检测的期望的增长，外泌体可能提供一个有价值的资源。
外泌体是30-nm的内体起源纳米囊泡，富含核酸、脂质和蛋白质。之前，研究人员报道了肿瘤来源外泌体蛋白在肿瘤进展、免疫调节和转移中的预后和功能重要性。此外，研究人员消除了细胞外纳米颗粒的异质性，定义了三个不同的亚群:小外泌体(Exo-S)、大外泌体(Exo-L)和外泌体，研究人员将它们统称为细胞外囊泡和颗粒(EVPs)。
越来越多的证据表明，EVPs可以用于癌症的早期检测、预后和指导治疗。EVP以个小泡/毫升的浓度被主动释放到外周循环中，为下游分析提供了充足的材料。基于质谱的蛋白质组分析正在成为深入了解循环EVPs的生物学和临床潜力的一种策略。尽管有几个EVP蛋白数据库，关于EVP蛋白质组还有很多未知，包括:(1)人体内EVP的可靠分离标记，而不考虑组织来源;(2)区分癌症与非癌症的标志物;(3)特异性原发肿瘤(如肺、胰腺、乳腺等)特有的标记物。
为了解决这一知识缺口，研究人员试图定义EVP蛋白标记，以区分癌症患者和健康个体。为了鉴定通用的EVP标记并改进人类EVP的分离，研究人员分析了份人类和小鼠样本的蛋白质组学分析。在传统的外泌体标记中，热休克同源蛋白71kDa蛋白(HSPA8)、热休克蛋白HSP90-beta(HSP90AB1)、CD9和程序性细胞死亡相互作用蛋白(ALIX)是在从细胞、组织和大多数生物液中分离的人源EVP中发现的最显著的标记。研究人员发现了另外13种与50%的人类样本共享的蛋白质，从而极大地扩大了人类EVP标记的范围。通过检查胰腺癌和肺癌患者可存活的手术标本中成对肿瘤和邻近组织的EVP蛋白组，研究人员确定了癌特异的EVP蛋白特征。此外，通过比较匹配的组织外植体(TE)和来源于等离子体的EVP，研究人员发现肿瘤患者血浆中独特的肿瘤相关EVP蛋白，并确定EVP蛋白来源于肿瘤微环境、远端器官和免疫系统。接下来，研究人员分析了一些儿童和成人癌症I期和IV期肿瘤的组织和血浆EVP蛋白组，并将其与非肿瘤组织和健康对照(HC)血浆进行比较。EVP蛋白组的随机森林分类显示，组织的癌症检测特异性和敏感性分别为90%和94%，血浆为95%和90%。重要的是，移植的EVP货物可以区分病人的癌症类型。这些数据提示肿瘤相关的EVP蛋白可以作为早期癌症检测的生物标志物，并将不确定的原发肿瘤类型进行分类。
图1：从7个不同来源的个样本中获得的EVPs的蛋白质组学特性
研究人员使用序列超离心分离法(SUC)从个正常和癌症相关的人和鼠源样本中分离出EVPs，包括细胞系、组织、血浆和其他体液(图1A)。SUC分离的所有EVP样本都代表了一个异质群体，该群体被分为三个突出的亚群体，包括外体细胞和两个外泌体亚群体(图1B)。通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)和透射电子显微镜(TEM)分别对异质EVP群体的大小范围(30-nm)和形态进行了表征(图1B)。研究人员建造了一个EVP数据库,从年人类样本,其中包括切除正常和恶性组织、血浆、细胞系、血清,骨髓,淋巴流体,和胆管液体标本(图1)。分析的癌症患者切除组织和血浆样本包括成人癌症(胰腺癌、肺癌、乳腺癌、结直肠癌和黑色素瘤)和儿童癌症(神经母细胞瘤和骨原性肉瘤)。独特的蛋白质中发现EVP的平均数量是(25%至75%百分位,年至年期间蛋白质),最低的多样性在血浆和血清(年和年的平均蛋白质在人血浆和血清,分别和年在小鼠血浆蛋白质)和TE的最高数量的蛋白质EVP。尽管对于某些特定的外泌体蛋白，其浓度随着癌症分期的增加而增加，但研究人员没有观察到非肿瘤和肿瘤样本中除细胞系外的大多数来源的不同EVP蛋白的数量的差异。
为了评估来自不同来源的EVP蛋白质组之间的整体相关性，研究人员对所有肿瘤和非肿瘤的EVP样本进行了Pearson相关性分析，比较了标本类型(血浆与TEs)和物种(人类与小鼠)。样本来源是EVP蛋白特征最强的决定因素(图1C)。最好从人血浆重叠EVP蛋白质与人类血清来源EVP,其次是人类骨髓和淋巴流体EVP,及相关至少与人类细胞系和TE-来源EVP,表明等离子体的复杂性和淋巴EVP蛋白质组可能驱动组织EVP的差异蛋白质组(图1c)。在种间差异方面，人和鼠细胞系和TE来源的EVPs的蛋白质组是相似的，而血浆来源的EVPs的蛋白质组在小鼠和人之间有很大差异(图1C)。无论将肿瘤样本或非肿瘤样本放在一起或单独分析，这些观察结果都是正确的(图1C)。这些数据表明，总的来说，EVP的特征因组织来源和物种的不同而显著不同，鼠血浆来源的EVP蛋白质体不能用于指导患者的液体活检研究。
无偏性EVP蛋白质组分析鉴定了13种常见的人类EVP生物标记物。为了更好地从不同的人和鼠源中分离出泛EVP标记物，研究人员研究了不同来源的EVP中发现的特定蛋白的频率。首先研究了传统的外泌体标记(如四虫素、热休克蛋白)，在11种传统的外泌体标记中，HSPA8是所有来源的50%的EVP样本中唯一发现的蛋白(图1D)。值得注意的是，尽管CD63存在于检测的89%的小鼠细胞系来源的EVP样本中，但它还是被检测到了较少出现在组织来源的EVP中，很少出现在从人类或小鼠来源的生物液中分离的EVP中(图1D)。在人类细胞系来源的EVP蛋白中，除CD63外，所有已建立的外泌体标记在个人类细胞系来源的样本中占77%(图1D)，这支持了SUC特异性地丰富外泌体制备的观点。重要的是，对细胞外纳米颗粒亚群蛋白质组数据的询问显示，在传统的外泌体标记中，CD9、TSG和CD81在Exo-S、Exo-L以及外泌体中被检测到。对于小鼠细胞系衍生的EVPs,11个标记均高表达(图1D)。然而，在人血浆或血清中，CD9和HSPA8是仅有的50%频率的蛋白(图1D)，这表明目前在细胞培养中用于验证外泌体来源的泛外泌体标记不能直接翻译到患者来源的生物液中。无论研究人员分析的是肿瘤来源的还是非肿瘤来源的标本，这些发现都是相似的，并强调了在人类标本中识别新的pan-EVP标记的必要性。
因此，为了识别在所有人源EVP中发现的高频率蛋白，而不考虑来源，研究人员寻找在样本中达到R50%代表性阈值的蛋白。在11,个人类EVP蛋白中，只有13个符合这个标准(图1E)。基因本体论(GO)分析表明，绝大多数这些蛋白，包括-2-大球蛋白(A2M)、b2-微球蛋白(B2M)、stomatin(STOM),细丝蛋白(FLNA),纤连蛋白1(FN1)gelsolin(GSN)、血红蛋白β亚基(HBB)galectin-3-binding蛋白质(LGALS3BP)ras-relaTEd蛋白质1b(RAP1B)beta-actin(ACTB),和multimericIgAIgM(JCHAIN)蛋白质贩卖可能通过核内体和内吞作用/胞外分泌的标志(图1f)。这13分子、ACTBmoesin(MSN,和RAP1B代表pan-EVP标记,可以识别在人类Exo-S/Exo-Lexomeres,而stomatin是一个特殊的外来体标记只有Exo-S/Exo-L可以区分。接下来，研究人员通过免疫印迹在细胞系、患者TE和血浆中验证了这些EVP标记(图1G)。此外，研究人员使用了第二种基于抗体的检测方法，即ExoView平台(NanoviewBioTEch,Inc.)，检测了来自三个独立供体的plasmaderiEVPs表面的B2M和单分散微球(图1H);因此，这些蛋白可用于改进基于亲和的从人血浆/生物液/组织中分离EVP的协议。这些EVP蛋白可能代表真正的外泌体标记。因为无论样本是肿瘤来源还是非肿瘤来源，这些标记都以相似的频率出现，所以它们可以用于改善任何和所有人类样本的外泌体分离。
图2：在手术切除的TEs中装载PaCa和luca特异性EVP蛋白
识别组织肿瘤来源EVP患者蛋白质识别EVP蛋白质可以用作癌症患者诊断生物标记,研究人员第一次试图识别共享和独特的肿瘤特异性蛋白质EVP通过EVP之间的两两比较肿瘤组织(TT)EVP蛋白质组,肿瘤EVP-丰富来源,与非相邻组织()EVP蛋白质组。分别从10例胰腺腺癌(PaCa)和14例肺腺癌(LuCa)患者中切除TT和AT，并分离EVPs进行两两比较(图2A)。此外，研究人员还获得了从LuCa患者身上切除的8个非肿瘤远处组织(DTs)，因为从肿瘤远端收集的非恶性组织不太可能受到肿瘤分泌因子的影响。从这些DTs中分离出来的EVPs被作为第三组纳入比较(图2A)。通过分析与AT和DT相比，TT中最丰富的EVP蛋白，研究人员发现了在PaCa和LuCa中具有潜在生物标志物价值和生物学相关性的独特EVP蛋白。研究人员搜索了50%样本中存在的EVP蛋白，并从中选择了与AT或AT/DT相比增长10倍或更大且错误发现率(FDR)为0.05的蛋白。基于这些标准，在PaCa和LuCa中分别鉴定出和个EVP蛋白为tTE富集蛋白(图2B)。
图3：EVPDAMP分子在PaCa和LuCa中富集
除了检查在TT中过多出现的EVP蛋白，研究人员还挖掘了数据集，找出了TT与AT/DT中不存在的EVP蛋白，并生成了一份在PaCa或LuCaTT样本中R50%检测到但在AT或DT中未发现的蛋白列表(图2C)。虽然研究人员鉴定了超过50种蛋白，包括ecm相关和促炎蛋白，这些蛋白只存在于PaCatt衍生的EVPs中，但研究人员发现只有两种蛋白，HIV-1Tat交互蛋白2(HTATIP2)和甲基转移酶样1(METTL1)，是LuCatt衍生的EVPs中唯一的蛋白(图2C)。值得注意的是，在PaCaTT中富集的前30个EVP蛋白中(图2B)，有4个蛋白flotillin2[FLOT2]、TPM3、IgE受体的Fc片段[FCER1G]和G蛋白亚基alphaQ[GNAQ])与肿瘤EVPs中单独发现的蛋白重叠(图2C)。在LuCa中，TT与AT/DT比较中发现的一种蛋白HTATIP2与肿瘤EVPs中仅存在的EVP蛋白重叠(图2B)，进一步验证了这些蛋白具有PaCa和luca特异性生物标志物的潜力。总的来说，这些数据表明，癌症EVP蛋白可能反映了选择性包装，并可以区分不同的癌症类型。研究人员发现39个EVP阻尼在PaCatt衍生的EVPs和at衍生的EVPs中高度富集(图3A)。其中，有6种存在于tt来源的蛋白在ATderivedEVPs中未被发现:SA13、BSG、LGALS9、biglycan(BGN)、inTEgrins(inTEgrins,ITGs)a5和aX。类似的分析显示，LuCa中有两种大量表达的潮湿EVP蛋白VCAN和LGALS9(图3B)。这些阻尼是有效的促炎分子(如LGALS9、SA13和BGN)或促炎细胞因子(如BSG和ITGs)的受体(Hernandezetal.，)。值得注意的是，VCAN和LGALS9在PaCa和LuCaTTEVPs中高度富集，这表明它们代表了癌症中EVP的炎症反应标记(图3A和3B)。有趣的是，某些DAMPs，如annexinA3(ANXA3)和一些ITGs(如ITGB2和ITGAV)在LuCa中富集，但在/DTEVPs中不富集PaCa。这一发现可能反映了AT/DT中肿瘤相关基质的存在(图3B)，并进一步强调了非肿瘤来源的EVP蛋白质组与肿瘤来源的EVP蛋白质组在识别特定癌症类型方面具有同样的信息。总的来说，在癌症或非癌症EVP中存在的独特阻尼可能有助于描述阻尼分子的促肿瘤作用和免疫原作用。
图4：多种肿瘤类型手术切除组织外植体中肿瘤相关EVP特征的鉴定
通过对多种癌症组织来源的EVP蛋白的分析，确定肿瘤相关的EVP特征已经确定了ttp特异性的EVP蛋白，接下来研究人员开始确定比较ttp来源和非ttp来源的EVP蛋白是否可以区分癌症和非癌症。研究人员分析了份组织外植体和20份骨髓来源的EVP样本。85个样本从TT中分离出来，而66个样本被归类为非TT(图4A)。研究人员使用随机森林分类，以确定一个子集的EVP蛋白，准确区分HC和肿瘤患者。在对模型进行训练和检验时，根据样本类型(即对照样本或肿瘤样本)对样本进行均匀分割，其中75%作为训练集，其余25%为独立测试集。基于16个EVP蛋白，应用10倍对训练集进行交叉验证，灵敏度(真阳性率)为95%，特异性(真阴性率)为92%(图4B)。当应用于独立测试集样本时，基于EVP蛋白子集的模型获得了90%的敏感性和94%的特异性，而基于TEEVPs中检测到的所有2,个蛋白的模型获得了%的敏感性和88%的特异性。这一结果可能部分受到组织特异性场效应的驱动，因为当聚焦于特定组织类型时，敏感性和特异性都有所提高。需要更大样本量的分析来进一步验证该模型，并了解组织特异性肿瘤相关EVP特征。尽管存在固有的组织特异性变异，但研究人员确定了最有可能区分癌症和非癌症的蛋白组合(图4A)。值得注意的是，在PaCa和LuCaTT中高度富集的EVP蛋白THBS2和VCAN在识别癌症中具有预测性，这表明这些蛋白可以作为泛癌EVP标记。此外，特异性EVP粘附标记(如CD36、TEnascinC[TNC]、THBS2和VCAN)和代谢酶(如全反式视黄醇脱氢酶[NAD(+)]ADH1B/醇脱氢酶1B[ADH1B]、腺苷同型半胱氨酸酶[AHCY]和磷酸甘油激酶1[PGK1])可能是泛癌标记。因为蛋白质组数据库的定期更新,作为原理的证明,研究人员的生物标志物识别管道在很大程度上是独立于数据库的更改,研究人员再分析整个细胞系,TE,等离子体数据集的最新迭代UniProt完整的人类蛋白质组。使用更新的数据集，研究人员在癌症检测中获得了90%的敏感性/94%的特异性(图4A、4B)。
图5：组织和血浆来源的evp中肿瘤相关蛋白的鉴定和验证
肿瘤、瘤周微环境和远处间质EVP蛋白有助于血浆中肿瘤相关的EVP特征，血浆仍然是液体活检最容易获得的来源。因此，为了了解肿瘤相关EVP蛋白的特征和组成，研究人员首先试图确定哪些蛋白存在于PaCa和LuCa患者的血浆中。然后，研究人员研究这些蛋白质是否来自于TT,AT/DT，或其他地方。研究人员分析了等离子体EVP蛋白质组患者(78%II期和III期22%)患者和12卢卡(II期阶段我50%,42%,和8%阶段III),选择EVP蛋白质中发现的在30%的病人血浆但从未28岁健康成年人的等离子体作为对照。分别发现了51个和19个专属于PaCa和LuCa的来自等离子体的EVP蛋白(图5A和5B)。为了确定这些EVP的可能来源，研究人员将这些等离子体来源的EVP蛋白与TT、AT和dt来源的EVP蛋白组进行了比较(图5A和5B)。有趣的是,蛋白质如脑特异性血管生成抑制剂1-associaTEd蛋白2蛋白1(BAIAP2L1),碱性磷酸酶,tissue-nonspecific同工酶(ALPL)receptor-typetyrosineproTEin磷酸酶埃塔(PTPRJ),高亲和性免疫球蛋白ε受体亚基γ(FCER1G)和细胞表面透明质酸酶(TMEM2),出现在在等离子体-和TT-来源的EVP中,但在所有16个at衍生的EVP样本中均以极低的水平包装或检测不到，表明这些蛋白极有可能来源于胰腺肿瘤细胞(图5A)。KRAS是一种驱动PaCa的致癌蛋白，经常被包装在TTEVPs中(76%)，并且可以在PaCa患者的血浆EVPs中检测到。
为了证明这些观察结果并不局限于LuCa和PaCa或一般成人癌症，研究人员检查了从患有两种最常见儿童实体癌症的晚期患者中分离出的TT和等离子体来源的EVPs:神经母细胞瘤和骨原性肉瘤(图5C和5D)。小儿癌症快速增长，超过了其发源地的器官，因此获取癌症非常具有挑战性。研究人员分析了9名神经母细胞瘤和7名骨原性肉瘤患者的tt来源的EVPs，以及15名神经母细胞瘤和5名骨原性肉瘤患者的浆源性EVPs(图5C和5D)。对15例儿童HC的血浆源EVP也进行了评估。研究人员的分析集中在33%的癌症患者血浆中检测到的EVP蛋白，但从未在任何对照受试者血浆中检测到。在神经母细胞瘤,研究人员发现10等离子体EVP蛋白质,铁蛋白重链(FTH1),角蛋白,I型细胞骨架17(KRT17),组蛋白H3.3(H3F3A)ATPbinding盒式sub-familyB成员9(ABCB9)disinTEgrin和金属蛋白酶与血小板反应蛋白图案13(ADAMTS13),CD14,红细胞膜蛋白带4.2(EPB42),肝细胞生长因子激活(HGFAC),角蛋白,I型细胞骨架13(KRT13)和KRT8c(图5),与细胞增殖/细胞周期和分化有关。
在骨肉瘤中，研究人员鉴定了6种血浆EVP蛋白，肌动蛋白、alpha骨骼肌(ACTA1)、肌动蛋白、-肠平滑肌(ACTG2)、ADAMTS13、HGFAC、neprilysin(MME)和TNC，它们与组织形态形成有关(图5D)。有趣的是，EVP蛋白质反映了每个癌症的细胞来源(成骨细胞和神经细胞)。为了验证topPaCa血浆EVP蛋白，研究人员基于最新的蛋白数据库对样本进行了重新分析，确认了topEVP蛋白列表。然后，研究人员选择了仅在PaCa血浆中发现但在28hc血浆中从未发现的前20个EVP蛋白。接下来，研究人员采用了一种靶向质谱方法，即平行反应监测(PRM)，来量化从15个PaCa和15个HC独立队列中分离的plasmaderiEVPs中的20个蛋白。80%的标记，如碳酸酐酶2(CA2)、乳铁蛋白(LTF)、BAIAP2L1、KRAS、磷脂二乙醇胺结合蛋白1(PEBP1)和CD55通过这种方法被验证(图5E和5F)。此外，三种paca特异性EVP蛋白CA2、LTF和CD55通过ELISA进行了验证(图5G)。总的来说，通过无偏性EVP蛋白质组学鉴定的16/20个PaCaEVP蛋白在PaCaEVPs中的表达水平高于HC。然后，研究人员基于最近的蛋白质数据库重新分析了LuCa数据集，发现LuCaEVPs中的RHOV持续升高。
使用ELISA，研究人员证实了14个卢卡EVP相对于7个HC血浆EVP的RHOV水平显著升高(图5H)。综上所述，数据表明来源于等离子体的EVP来源于不同的来源，并且EVP蛋白质组分析可以在可切除和晚期疾病中识别出肿瘤类型特异性的血浆EVP蛋白。通过比较等离子体来源和组织来源的EVP蛋白，研究人员可以区分肿瘤来源、邻近组织来源和远端器官的EVP。此外，癌症患者的血浆EVP蛋白特征与对照组不同，而且具有癌症类型特异性，这表明EVP蛋白谱可以作为液体活检工具来检测癌症和区分癌症类型。
图6：不同癌症患者血浆中与肿瘤相关的EVP特征的鉴定
通过对多种癌症的等离子体来源的EVP蛋白的分析，识别肿瘤相关的EVP特征。采用与对组织样本相同的方法，研究人员探索了肿瘤相关的血浆EVP特征。分析来自16种不同癌症类型的77名癌症患者的个血浆来源的EVP蛋白组，包括乳腺癌、肺癌或胰腺癌、间皮瘤和神经母细胞瘤，以及43名HC受试者(图6A)。训练集的十次交叉验证产生了%的敏感性和82%的特异性(图6B)。研究人员的模型达到了95%的敏感性和90%的特异性，表明组合不同的免疫球蛋白相关蛋白对检测癌症最有预测性(图6A和6B)。使用血浆EVPs中检测到的个蛋白生成模型，灵敏度为%，特异性为92%(图6B)。值得注意的是,预测蛋白质区分癌与非癌不仅包括等离子体来源EVP蛋白质存在于癌症患者,而且这些蛋白质正常血浆EVP中发现缺失或出现在癌症患者血浆低水平EVP,进一步支持了这种观点,即癌与非癌歧视也应该考虑那些迷失在癌症的蛋白质EVP(图6)。此外，研究人员还基于最新的蛋白数据库重新分析了血浆数据集，确认了顶级蛋白列表以及%敏感性/80%特异性的验证结果。综上所示，研究结果表明，来源于等离子体的EVP蛋白可用于癌症检测的液体活检试验。
图7：肿瘤来源的EVP剖面对原发肿瘤进行了分类
患者肿瘤组织衍生的EVP蛋白质组学对癌症类型进行了分类，研究人员下一步寻找的是确定患者的EVP蛋白特征是否可以被分配到特定的癌症类型。研究人员分析来自四种不同癌症类型:黑色素瘤、结肠直肠癌、胰腺癌和肺癌患者的原发肿瘤或前哨淋巴结组织的EVP蛋白(图7A)。为了识别能够区分四种肿瘤类型的蛋白特征，采用随机森林分类和t-随机邻居嵌入(t-SNE)进行可视化。研究人员能够正确区分每个肿瘤样本，如图7A所示。使用无监督主成分分析(PCA)和有监督的3Dt-SNE图来可视化样本之间的差异(图7B)。随机森林的特征选择鉴定出29个EVP蛋白，其中一些与免疫功能有关，在鉴别分析的四种癌症中具有最高的预测价值(图7C)。基于这些EVP蛋白，样本根据原发肿瘤类型聚集在一起。有趣的是，根据t-SNE可视化和随机森林分类结果，EVP特征的肿瘤特异性与癌症分期无关，甚至可以在早期区分癌症，尤其是在PaCa和LuCa(图7B)。
因此，组织活检(如淋巴结)的EVP谱有助于对癌症类型进行分类，支持诊断，从而为原发肿瘤来源不明的癌症患者提供更具体的治疗方案。由于组织活检并不总是可用来确认肿瘤的类型，研究人员使用来自五种不同癌症患者的血浆提取的EVP蛋白组进行了类似的分析，这些癌症包括乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌和间皮瘤。与研究人员对癌症与非癌症血浆的分析相似，在30种能够区分癌症类型的EVP蛋白中，免疫球蛋白是在大多数血浆来源的EVP样本中发现的最常见的蛋白家族，尤其是在间皮瘤和LuCa中(图7F)。重要的是，发现所有分析的五种癌症类型的样本都是基于原发肿瘤类型而不考虑癌症分期的。这些发现为等离子体来源的EVPs蛋白组代表了真正的肿瘤特异性信号，能够区分癌症类型，而不依赖于它们的分期提供了原则证据。总的来说，对于原发肿瘤来源不明的癌症患者，来自组织和等离子体的EVP蛋白组在确定肿瘤类型方面是有益的。
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本文编辑：佚名
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