//研究背景
已确定NSCLC肿瘤中的许多体细胞突变，致癌性重排或拷贝数变异。目前尚无针对KRAS突变（G12C，G12V或G12D）的NSCLC患者的具体治疗策略，在KRAS突变的NSCLC中已鉴定出常见的共突变伴侣如TP53和LKB1。已有表达突变的KrasG12D并同时使Tp53（KP）或Lkb1（KL）失活小鼠模型。
检查点免疫疗法如抗程序性死亡1（anti-PD1）和抗程序性死亡配体1（anti-PD-L1）抗体显著改善总NSCLC患者生存率（OS）。但在PD-L1阳性水平较高的NSCLC患者中，客观缓解率（ORR）约为45％。
趋化因子配体7（CCL7）是从MG-63骨肉瘤细胞培养上清中表征的单核细胞的趋化因子和强引诱剂。CCL7在内皮细胞和单核细胞中等低水平表达，并受各种刺激上调。包括CCR1，CCR2和CCR3在内的CCL7受体主要在抗原呈递细胞（APC）的表面表达，如单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞（DC）。CCL7在抗感染免疫中发挥着重要作用。
//研究结果
1.CCL7在NSCLC肿瘤组织中高表达
图1
为验证趋化因子可能有助于免疫细胞向TME的浸润从而在肿瘤发生和肿瘤发展中发挥关键作用，从楔形切除或肺叶切除的NSCLC患者（组1）中收集了18种肿瘤和正常肺组织，分析表明肿瘤组织中CCL7的mRNA水平高于正常组织（图1a）。收集另一组肿瘤和正常肺组织（组2）并确认CCL7在肿瘤组织中高表达(图1b),与基因表达谱交互分析(GEPIA)数据一致。免疫组化(IHC)和集成光密度(IOD)分析肿瘤和正常肺组织的NSCLC组织阵列(组3)，肿瘤组织中CCL7蛋白水平高于正常肺组织(图1c)。高CCL7蛋白水平与NSCLC患者OS呈正相关（图1d）。进一步发现，晚期肿瘤中的CCl7mRNA水平高于早期肿瘤，但CCL7的蛋白水平相当，表明CCL7的表达受转录和转录后水平调节。
2.CCL7在多种细胞的肿瘤发生过程中上调
作者建立CCl7IRES?ZsGreen报告小鼠，但其只在小鼠肺成纤维细胞中感染HSV-1或IFN处理后上调。者建立了KrasLSL-G12D/+Tp53fl/flCCl7IRES-ZsGreen（KP7ZsGreen）小鼠，并通过鼻内注射Ad-Cre10周诱导了其的NSCLC（图1e）。流式细胞仪分析表明，CCL7IRES-ZsGreen在CD11c+CD11b-H-2Kb-CD-肺泡巨噬细胞（AMs）中表达，而在CD11c+CD11b-H-2Kb+CD+树突状细胞（DCs）、CD11b+CD11c-细胞、B细胞、T细胞中不表达（图1e-g）。在CD45.2-CD31+CD81-CD49d-内皮细胞、CD45.2-CD31-CD81+CD49d-成纤维细胞和CD45.2-CD31-CD31-CD81-CD49d-肿瘤细胞中发现CCL7IRES-ZsGreen，但CD45.2-CD31+CD49d+基质细胞未发现。综上，在肿瘤诱导后，KP小鼠肺部多种细胞中的CCL7被上调。
3.CCL7缺乏促进KP小鼠模型的肿瘤发生
图2
作者用KP小鼠模型研究了CCL7在原发性NSCLC发展中的作用。将CCl7?/?鼠与KP鼠杂交，产生KP7小鼠，通过鼻内注射Ad-Cre诱导肺肿瘤发生(图2a)。如图2b，KP7小鼠OS的中位数为82天，而KP小鼠OS中位数更长。组织学分析显示，肿瘤诱导6周，KP或KP7小鼠肺中的肿瘤数量和体积大小相当(图2c，d)，而在诱导后8或10周，KP7小鼠的肺中的肿瘤大小和面积明显大于KP小鼠(图2e，f)，表明CCL7缺乏在早期不影响NSCLC肿瘤开始，但在晚期抑制肿瘤的进展。
4.CCL7缺乏削弱cDC1向肿瘤负荷肺浸润
图3
作者分析诱导肿瘤后10周KP和KP7小鼠肿瘤负荷肺中骨髓细胞浸润的百分比和数量(图3a)。KP7肺的总细胞数比KP肺多，可能因KP7小鼠的肿瘤体积较大(图3b)。流式细胞术分析表明，与KP小鼠相比，KP7小鼠肺中CD11c+CD11b-细胞的百分比和细胞数量显著减少(图3c)，而CD11c-CD11b+F4/80+巨噬细胞或CD11c-CD11b+Ly6g+中性粒细胞数量在KP或KP7小鼠的肺中相当。与KP小鼠相比，KP7小鼠的肿瘤负荷肺表达高水平CD86、XCR1和CD24，但低水平的CD64在KP7小鼠的肿瘤负荷肺中显著降低(图3d，e)。发现与CD11c+CD11b-CDH-2Kb+泡巨噬细胞或CD11c-CD11b+细胞相比，CCL7受体CCR1、CCR2和CCR3在cDC1上高度表达(图3e)。综上，在KP小鼠模型中CCL7主要引起肿瘤负荷肺中的cDC1。
作者发现KP或KP7小鼠肺部的CD11c+CD11b-细胞中CD、H-2Kb+的百分比相当(图3d)。来自KP或KP7小鼠肺的cDC1也表达相当的CD86、XCR1、CD24或CCL7受体(图3e)，说明CCL7缺陷不影响cDC1的激活或分化及CCL7受体表达。在肿瘤诱导后10周，KP7鼠的肺肿瘤中的cDC1数量明显少于KP小鼠，且CD11c、CD和XCR1浓度明显低于KP小鼠(图3d，f)。综上，CCL7是CD1最佳浸润所必需，但不是激活浸润的cCD1必需。
5.CCL7缺乏阻碍抗肿瘤免疫反应的激活
图4
作者分析了支气管引流淋巴结（dLNs）中的适应性免疫反应，KP7鼠的支气管dLN的总细胞数明显少于KP小鼠的总细胞数（图4a）。肿瘤诱导后10周，在KP和KP7鼠中，T细胞在支气管dLNs中百分比相当，但与KP鼠相比，KP7鼠支气管dLNs的T细胞显著减少(图4b)。表明在KP小鼠模型中诱导肿瘤后，CCL7缺乏会阻碍支气管dLNs中CD8+T细胞扩增。
作者接下来从KP和KP7小鼠的肿瘤负荷肺中分离出肺浸润淋巴细胞（LIL），流式细胞仪分析表明，与诱导肿瘤后10周KP肺相比，KP7肺中肺LILs的总细胞数明显减少（图4c）。与KP7小鼠LIL相比，KP小鼠T细胞数量减少（图4d，e）。进一步表明KP7小鼠肺中T细胞的浸润减少不是因CCL7缺乏。KP和KP7小鼠在支气管dLN和T等细胞的百分比是可比的（图4b，d）。综上，CCL7缺乏会损害KP小鼠模型的支气管dLN和肿瘤负荷肺中T细胞扩增和积累。
6.CD11c+或Zbtb46+DCs的消耗促进了KP小鼠模型中NSCLC发展
图5
作者将CD11c-白喉毒素受体（DTR）骨髓细胞转移到了经辐射KP或KP7小鼠，进行肿瘤诱导和DT介导的CD11c+细胞的耗竭（图5a）。如图5b，通过DT处理有效地消除了KP或KP7小鼠肺中的CD11c+或CD11c+CD+H-2Kb+DCs。CD11c+DC的耗竭基本上促进了KP和KP7小鼠的NSCLC发展（图5c，d）。经DT处理的KP和KP7小鼠中，肿瘤负荷和生长情况相当（图5c，d），表明在KP小鼠模型中，CCL7介导的CD11c+DC募集在抑制肿瘤发生中起着重要作用。同样，经DT处理后，来自KP或KP7小鼠的支气管dLN和LIL中的T细胞以及CD8，XCR1染色强度显著降低（图5e-g）。
接着将Zbtb46-DTR骨髓细胞转移到受辐射的KP或KP7小鼠中，进行肿瘤诱导和DT处理，结果表明DT显着促进了KP小鼠的肿瘤发生。DT处理后支气管dLN中的总细胞数、CD4+或CD8+T细胞数量减少。与PBS组相比，DT处理后KP小鼠的XCR1和CD8染色明显降低。综上，CCL7对于募集cDC以促进KP小鼠模型中的T细胞抗肿瘤免疫反应至关重要。
7.在KP小鼠模型中用CCL7会抑制NSCLC
作者推测CCL7可通过调节TME中的免疫应答作为NSCLC的治疗剂，慢病毒表达Cre重组酶（Lenti-Cre）并鼻内注射到KP小鼠中。在肿瘤诱导后8周，CCL7显着延长KP小鼠的存活并抑制肿瘤发展，并促进肿瘤负荷肺中cDC1浸润。与对照相比，注射了CCL7的KP鼠中CD8+IFNγ+T细胞、支气管dLN和LIL数量增加，表明CCL7促进cDC1和CD8+T细胞的渗透和扩增，以引发抗肿瘤免疫力。
图6
作者设计了另一个模型，向KP或KP7小鼠鼻内注射Ad-Cre,6周后再向小鼠鼻内注射lentivec或Lenti-CCL7(图6a)。IHC分析证实注射Lenti-CCL7的KP或KP7鼠的肺中CCL7的表达（图6b）。与对照组相比，注射CCL7可以显着延长KP或KP7小鼠的生存期并抑制其肿瘤的发展（图6c-e）。与注射对照病毒的鼠相比，注射CCL7的KP或KP7小鼠的肿瘤肺中浸润性cDC1数量及CD11c，XCR1和CD8染色的强度增加（图6f，g）。综上，CCL7在KP小鼠模型中充当NSCLC治疗剂。
8.CCL7增强抗PD-1检查点免疫疗法的作用
图7
作者推测抗PD-1治疗可能会增强KP小鼠的抗肿瘤免疫力，而CCL7可能增强了抗肿瘤免疫力。在存在或不存在腹膜内注射抗PD-1的情况下，每周两次向KP小鼠鼻内注射Ad-Cre，然后Lenti-Vec或LentiCCL7注射，持续4周（图7a）。如图7b，抗PD-1治疗显着延长了KP小鼠存活时间。抗PD-1治疗显着抑制了KP小鼠的肿瘤发展，与溶媒组相比，其通过联合注射CCL7被进一步抑制（图7c）。CCL7和抗PD-1的联合治疗显着增加了KP小鼠肺中CD11c+或XCR1+DC和CD8+T细胞的浸润（图7d，e）。
作者进一步在KL鼠中研究了CCL7是否有相同的作用。结果表明CCL7促进cDC1-CD8+T细胞轴，以促进KP和KLNSCLC小鼠模型中的抗PD-1检查免疫疗法。
//总结与讨论
本研究表明CCL7募集cDC1以在KP和KLNSCLC小鼠模型中促进抗肿瘤反应并增强抗PD-1治疗的功效，表明CCL7可以作为抗PD-1检查点免疫疗法的佐剂。抗PR-1疗法的PR或SD患者的CCL7水平显着高于抗PD-1的患者，这表明TME中除PD-L1以外的CCL7作为潜在的预测指标用于NSCLC患者的抗PD-1/PD-L1检查点免疫疗法。
//原文信息
本文于年11月30日发表于NATURECOMMUNICATIONS，ManZhang、WeiYang为共同第一作者，通讯作者为DandanLin、QianChu、BoZhong，通讯地址为武汉大学。
原文
本文编辑：佚名
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